在所有科學(xué)儀器中，可能沒(méi)有人比光學(xué)顯微鏡對(duì)它的改進(jìn)有更多的思考和投入。在過(guò)去幾個(gè)世紀(jì)中，它的發(fā)展一直受到科學(xué)家的推動(dòng)，他們希望觀察和測(cè)量比以往任何時(shí)候都更小，更微弱（圖1）和更深的組織內(nèi)部現(xiàn)象。

圖1顯示了當(dāng)今改進(jìn)型顯微鏡產(chǎn)生的圖像的示例，該圖像說(shuō)明了在Eclipse E600顯微鏡上使用CFI60 40X螢石物鏡和尼康的DXM1200數(shù)碼相機(jī)對(duì)組織培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行數(shù)字捕獲的多色熒光圖像。

一個(gè)世紀(jì)前，顯微鏡達(dá)到了光的經(jīng)典理論所預(yù)測(cè)的分辨率極限。但是，需要更多的分辨率才能使顯微鏡實(shí)時(shí)檢查活細(xì)胞的內(nèi)部運(yùn)作。以前由極少數(shù)技術(shù)大師在極少數(shù)實(shí)驗(yàn)室中完成的技術(shù)現(xiàn)在簡(jiǎn)化為常規(guī)的常規(guī)臨床程序。顯微鏡設(shè)計(jì)人員認(rèn)真聽(tīng)取了顯微鏡學(xué)家的意見(jiàn)，帶來(lái)了巨大的創(chuàng)新。本文總結(jié)了顯微鏡設(shè)計(jì)的進(jìn)展，并著重于最近開(kāi)發(fā)的光學(xué)系統(tǒng)如何促進(jìn)科學(xué)進(jìn)步。

有限與無(wú)限光學(xué)系統(tǒng)

在生物顯微鏡相對(duì)簡(jiǎn)單的日子里，在落射熒光和共聚焦技術(shù)之前，幾乎不需要在物鏡和目鏡之間插入較厚的光學(xué)組件-透鏡間空間。標(biāo)準(zhǔn)的160或170毫米鏡筒長(zhǎng)度，物鏡安裝法蘭與目鏡座之間的距離非常適合此操作。這些儀器在中間透鏡空間會(huì)聚了光線。冶金學(xué)家和地質(zhì)學(xué)家需要偏振光，在發(fā)明薄晶圓偏振器之前，這需要在該空間中插入大型棱鏡和其他附件。1930年代，一家制造商的標(biāo)準(zhǔn)管空間不足，并且由于棱鏡而引起的像差校正問(wèn)題困擾，他們首先嘗試使用無(wú)窮大光學(xué)器件來(lái)解決這些問(wèn)題。

術(shù)語(yǔ)“無(wú)限遠(yuǎn)”是指將物鏡設(shè)計(jì)為將其圖像投影到無(wú)限遠(yuǎn)而不是有限的距離。無(wú)限光學(xué)系統(tǒng)在物鏡和目鏡之間提供了平行光區(qū)域。使用這些系統(tǒng)，可以在不引入光學(xué)像差或減小物鏡的自由工作距離的情況下，將復(fù)雜的光學(xué)組件插入該平行光空間。該系統(tǒng)還保留了目標(biāo)集的共聚焦性（圖2）。呈現(xiàn)在圖2中圖1是CFI60光路的概念圖。Infinity光學(xué)系統(tǒng)由一個(gè)物鏡，一個(gè)會(huì)聚光束的套筒透鏡和一個(gè)目鏡組成。可以將模塊和組件放置在物鏡和套管透鏡之間的平行光路上，以創(chuàng)建一個(gè)靈活的系統(tǒng)，而無(wú)需其他中繼光學(xué)系統(tǒng)。像點(diǎn)的位置在軸向和橫向都保持恒定，在物鏡和套筒透鏡之間的對(duì)準(zhǔn)也是如此。

當(dāng)然，要形成我們可以看到或記錄的圖像，來(lái)自無(wú)限遠(yuǎn)型物鏡的光必須通過(guò)管狀透鏡或第二物鏡再次在平行光空間和目鏡之間會(huì)聚。通常，在不降低性能的情況下，可以將兩個(gè)主要光學(xué)組件放置在該空間中，一種情況下最多三個(gè)。

現(xiàn)在可以設(shè)計(jì)附件和插入的組件，以實(shí)現(xiàn)正好1倍的放大倍率，這在將幾種光學(xué)技術(shù)與同一樣品進(jìn)行比較時(shí)很有價(jià)值。例如，當(dāng)安裝了落射熒光和微分干涉對(duì)比（DIC）光學(xué)器件時(shí)，仍然有空間容納第三個(gè)設(shè)備-放大倍率轉(zhuǎn)換器，示教頭，用于兩個(gè)攝像機(jī)的多端口組件或用于與數(shù)字化板以跟蹤神經(jīng)元。

在數(shù)年前的經(jīng)典顯微鏡中，鏡片設(shè)計(jì)者可以在校正像差，球面和色差（軸向和橫向）像差，彗形像差，像散和像場(chǎng)彎曲時(shí)綜合考慮物鏡和目鏡。橫向色差（LCA）也稱(chēng)為倍率色差-在同一焦平面上形成紅色，綠色和藍(lán)色圖像，但每種顏色形成不同尺寸的圖像。

傳統(tǒng)上，LCA很難校正，通常在物鏡中未經(jīng)校正，無(wú)法在目鏡中進(jìn)行補(bǔ)償。幾年前，光學(xué)眼鏡的種類(lèi)和計(jì)算技術(shù)不足以在目標(biāo)范圍內(nèi)校正LCA。在未校正的中間透鏡光束中插入較厚的分量會(huì)進(jìn)一步擾亂光學(xué)校正。

即使在今天，并非所有制造商都已在目標(biāo)范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)了LCA的校正。尼康公司（紐約州梅爾維爾）開(kāi)發(fā)的新型玻璃配方的色散極低。因此，所有像差都會(huì)在物鏡本身內(nèi)得到校正。該公司于1976年推出了經(jīng)過(guò)校正的CF（無(wú)色差）物鏡，并且這項(xiàng)新技術(shù)在CFI60（無(wú)鉻無(wú)窮遠(yuǎn)，60毫米共焦肩高），物鏡，目鏡（尼康）中不斷發(fā)展。在設(shè)計(jì)具有無(wú)限長(zhǎng)管長(zhǎng)度的各種顯微鏡系統(tǒng)中，只有這一系統(tǒng)結(jié)合了充分利用這一概念所必需的其他設(shè)計(jì)更改。

新鏡頭

無(wú)限遠(yuǎn)顯微鏡系統(tǒng)理想物鏡的設(shè)計(jì)比通常的透鏡元件要多，因?yàn)槌錾涔馐仨毦劢乖跓o(wú)限遠(yuǎn)處。此外，對(duì)熒光技術(shù)的要求，例如M-FISH（多色熒光原位雜交）（圖3），其基于收集盡可能多的光子，并且需要更高數(shù)值孔徑（NA）的透鏡。除此之外，共焦技術(shù)對(duì)高NA，長(zhǎng)工作距離鏡片的要求也很深，可以穿透到厚組織中。為了滿(mǎn)足這些需求，當(dāng)今的鏡片必須具有更大物理直徑的玻璃元件。綜上所述，這些要求使舊的鏡片尺寸標(biāo)準(zhǔn)過(guò)時(shí)了。圖3中顯示的示例是成纖維細(xì)胞的多色熒光圖像，使用CFI60 60X，NA 1.4油浸物鏡用Eclipse E800顯微鏡在膠片上捕獲。

英格蘭顯微學(xué)會(huì)在1800年代中期制定的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定了物鏡安裝螺紋的直徑。這個(gè)尺寸雖然很寬敞，并且適合于舊的黃銅顯微鏡，但卻成為光學(xué)設(shè)計(jì)的嚴(yán)格限制。此外，以前的共焦肩高行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（從樣品到物鏡安裝法蘭的距離）不足以解決當(dāng)前設(shè)計(jì)的復(fù)雜性。這些尺寸的新標(biāo)準(zhǔn)（25毫米螺紋直徑和60毫米齊焦肩高，尼康）使創(chuàng)新的新型鏡片成為可能，并確保有足夠的改進(jìn)空間。套筒透鏡的焦距為200毫米，可以使透鏡具有很長(zhǎng)的工作距離和較高的NA。

所述CFI60透鏡具有更高的NA比通?？捎糜跇?biāo)準(zhǔn)放大倍率，提供增加的細(xì)節(jié)的分辨率，更高的聚光功率，并在共聚焦應(yīng)用的高性能。Eclipse儀器的許多物鏡共有的特性是比正常工作距離長(zhǎng)。這樣就可以將厚厚的樣品從上到下聚焦，而不必?fù)?dān)心破壞蓋玻片或損壞物鏡本身。浸入油和更換樣品一樣容易。可以使用厚底的腔室，使用更高放大倍率的鏡頭可以進(jìn)行顯微操作。

在現(xiàn)在揭示細(xì)胞內(nèi)部機(jī)制和動(dòng)態(tài)活性的研究中，熒光發(fā)射的每個(gè)光子都是珍貴的。以的效率收集這些參數(shù)需要具有盡可能高的數(shù)值孔徑的目標(biāo)。Plan Fluor 40X NA 1.30油浸透鏡結(jié)合了放大倍率，高NA，視野平坦度，長(zhǎng)工作距離和高紫外透射率，為熒光研究的高效工作而優(yōu)化。對(duì)于同等放大率的鏡頭，落射照明系統(tǒng)中的圖像亮度與數(shù)值孔徑的四次方成正比。計(jì)算表明，將0.65 NA的普通高干鏡片與1.30 NA的40X浸入式鏡片進(jìn)行比較，可獲得16倍的亮度增加。

更好的高干燥圖像

對(duì)于普通的非浸入式40X物鏡，即所謂的高干鏡頭，有很多觀察結(jié)果。在此放大倍率下，物鏡需要較高的NA才能提供40X放大倍率應(yīng)顯示的細(xì)節(jié)豐富度。通常為40倍鏡頭提供的NA為0.65。即使在此數(shù)值孔徑下，顯微鏡的光學(xué)性能也取決于透鏡設(shè)計(jì)者和制造商無(wú)法控制的光學(xué)組件-樣品頂部的蓋玻片。顯微鏡制造商建議蓋玻片的厚度為0.17 mm，然后將其刻在物鏡的主體上（按照實(shí)驗(yàn)室補(bǔ)給屋的標(biāo)準(zhǔn)，相當(dāng)于＃1 1/2蓋玻片）。

許多標(biāo)本都準(zhǔn)備有其他厚度的蓋玻片。這對(duì)于低倍率觀測(cè)幾乎沒(méi)有影響，但在40倍及更高倍數(shù)時(shí)具有很強(qiáng)的影響力。用鏡頭設(shè)計(jì)師的話來(lái)說(shuō)，非標(biāo)準(zhǔn)的蓋玻片會(huì)破壞物鏡的球差。用用戶(hù)的眼光看，圖像失去對(duì)比度，顯得模糊。

0.65是普通40X鏡頭的NA，而更高性能的干物鏡可高達(dá)0.95。這些受到蓋玻片厚度的不利影響，因此必須在物鏡上安裝校正環(huán)。在觀察圖像外觀的同時(shí)可以通過(guò)旋轉(zhuǎn)圖像來(lái)優(yōu)化圖像質(zhì)量。轉(zhuǎn)動(dòng)項(xiàng)圈會(huì)改變物鏡某些組件的內(nèi)部間距，不幸的是，這也會(huì)改變鏡頭的有效聚焦。實(shí)際上，在尋找最清晰圖像的同時(shí)，必須一只手同時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)衣領(lǐng)，另一只手同時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)精細(xì)聚焦旋鈕。許多用戶(hù)從未掌握過(guò)該技術(shù)。高NA，高干鏡頭（Nikon）的設(shè)計(jì)極大地減少了焦點(diǎn)偏移，從而使圖像質(zhì)量的優(yōu)化更加容易。對(duì)于NA高于0.95的情況，可提供浸沒(méi)式透鏡。

通用目標(biāo)

除了普通的明場(chǎng)以外，每個(gè)制造商都為觀察技術(shù)列出了不同的特殊物鏡，例如相差，DIC和熒光技術(shù)。使用多種技術(shù)的研究人員曾經(jīng)需要為任何給定的放大倍數(shù)購(gòu)買(mǎi)其中一些物鏡。到目前為止，要在不顯著降低性能的情況下為這四個(gè)目的設(shè)計(jì)一個(gè)目標(biāo)是不可能的。Plan Fluor DLL鏡頭（Nikon）在所有這四種模式下均能工作，而不會(huì)犧牲圖像質(zhì)量。它們節(jié)省了金錢(qián)，便利性和鼻梁架上的空間

功耗目標(biāo)

在生活中，我們通常會(huì)首先概覽整個(gè)場(chǎng)景，然后放大引人注目的細(xì)節(jié)。在顯微鏡下，我們首先從低功率開(kāi)始，然后再轉(zhuǎn)向高功率。病理學(xué)家，學(xué)家和植物學(xué)家是眾多生命科學(xué)專(zhuān)業(yè)人士中的一員，他們經(jīng)常依靠低功率進(jìn)行定向并從字面上“了解全局”。但是，在許多顯微鏡上，使用10倍物鏡和10倍目鏡的功率為100倍，與自然尺寸相比有了很大的飛躍。由于顯微鏡師通常不愿更換低功率目鏡，因此低功率物鏡是較低放大倍率的。

借助CFI60 0.5X物鏡，用戶(hù)可以在廣闊的視野中進(jìn)行觀察和拍照。在50 mm的實(shí)際視場(chǎng)中，該物鏡可用于大型標(biāo)本的宏觀觀察，例如圖4所示的ilia樹(shù)莖細(xì)切面。與傳統(tǒng)的無(wú)限遠(yuǎn)光學(xué)系統(tǒng)相比，物鏡提供的圖像區(qū)域的大小大五倍以上。可以在35毫米膠片上進(jìn)行實(shí)際尺寸的攝影。

主要制造商提供的目標(biāo)約為。4X，2X甚至1X功率。CFI Macroplan 0.5X物鏡及其特殊配件可在目鏡上呈現(xiàn)5X圖像，并將在35毫米膠片上拍攝自然尺寸的1X圖像（請(qǐng)參見(jiàn)圖4）。鏡頭提供了的細(xì)節(jié)和色度校正，使顯微鏡可以提供的放大倍率。

人機(jī)工程學(xué)設(shè)計(jì)

顯微鏡不僅僅是光學(xué)。它是科學(xué)家與人體最接觸的實(shí)驗(yàn)室儀器。當(dāng)購(gòu)買(mǎi)一次可能要坐幾個(gè)小時(shí)的樂(lè)器時(shí)，考慮身體舒適性至關(guān)重要。這是在規(guī)格表中無(wú)法輕易表達(dá)的東西。必須親身經(jīng)歷。

在許多較舊的顯微鏡（甚至是一些較新的顯微鏡）中，各種控件都放置在對(duì)制造商的位置。有時(shí)這會(huì)導(dǎo)致尷尬或不便。

所有主要制造商都已將人機(jī)工程學(xué)考慮因素納入他們的展臺(tái)設(shè)計(jì)中，但是Eclipse儀器將人機(jī)工程學(xué)因素納入了更高的層次。設(shè)計(jì)中考慮了有關(guān)用戶(hù)如何坐在他們的儀器上的廣泛研究，方便到達(dá)距離的測(cè)量以及手臂和頭部舒適位置的確定。圖5（a）中將E800顯微鏡上的載物臺(tái)手柄和聚焦控制旋鈕的位置與傳統(tǒng)顯微鏡進(jìn)行了比較。通過(guò)保持自然姿勢(shì)并使雙手與身體等距，可以減輕壓力。此外，舞臺(tái)把手和精細(xì)對(duì)焦旋鈕的位置也可以用一只手操縱，從而提高了舒適的觀察力。尼康的許多顯微鏡都提供直立和傾斜的目鏡鏡筒（圖5（b）），以確保通過(guò)使用自然位置的系統(tǒng)提高檢查效率并提高操作員的舒適度。

此外，向中間透鏡空間添加部件并非總是舒適地完成的。如果像大多數(shù)制造商一樣，僅將組件堆疊在一起，并且將雙目觀察頭和目鏡放在它們的頂部，則結(jié)果通常是令人不舒服的高視線布置，用戶(hù)會(huì)彎腰脖子窺視目鏡。在Eclipse中，最多三個(gè)組件插入到中間透鏡空間中，而無(wú)需更改儀器的恒定，方便的眼睛位置。

在新的展臺(tái)中，無(wú)論制造的難易程度如何，的控件都放在顯微鏡專(zhuān)家的位置。相互結(jié)合使用的控件（例如舞臺(tái)移動(dòng)和精細(xì)對(duì)焦）已放置在可以用同一只手的手指進(jìn)行調(diào)整的位置。前臂舒適地放在桌面上，的控件自然落在指尖下。載物臺(tái)的位置低得多，方便了更換幻燈片。舞臺(tái)控制器可以安裝在任何一側(cè)，以進(jìn)行左側(cè)或右側(cè)操作。

展臺(tái)上新設(shè)計(jì)的其他特性包括大大增強(qiáng)的時(shí)間和熱穩(wěn)定性，這對(duì)于隨時(shí)間推移進(jìn)行的研究（例如有絲分裂研究和胚胎學(xué)）非常重要。還增加了振動(dòng)阻尼，以提高捕獲圖像的分辨率。

結(jié)論

是否創(chuàng)建了光學(xué)顯微鏡？盡管市場(chǎng)上的新儀器已將顯微鏡帶入了一個(gè)高水平的發(fā)展階段，但只要科學(xué)研究繼續(xù)下去，我們可能就永遠(yuǎn)無(wú)法實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)。未來(lái)的需求將需要我們甚至無(wú)法預(yù)見(jiàn)的創(chuàng)新。但是，當(dāng)今樂(lè)器為用戶(hù)提供的性能和多功能性要比幾年前高得多。