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高效液相色譜法是上個(gè)世紀(jì)70年代左右極速發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)高效、快速的分離、分析技術(shù)。液相色譜法意思***指流動(dòng)相為液相的一種新型色譜技術(shù),在正規(guī)的液相色譜法的基礎(chǔ)上,引 入氣相色譜法理論,我們一般在技術(shù)運(yùn)用高壓泵、高靈敏的檢測(cè)器與高效固定相,能快速實(shí)現(xiàn)分析、操作自動(dòng)化還有分析效率也很高,它具有高壓、高速、高效、高靈敏度等特 點(diǎn)。用法是用高壓把不同極性的單獨(dú)的溶劑或者不痛比例的混合溶劑緩沖等流動(dòng)相裝在固定相的色譜柱然后經(jīng)過(guò)閥門倒入供試品里面。由流動(dòng)相帶入柱子里面。柱內(nèi)各個(gè)成分被分離后依次進(jìn)入檢查器里面。

    高效色譜柱對(duì)于高效液相色譜柱很重要，通常一般把它說(shuō)明為心臟。,在高效液相色譜儀的 使用中,保持色譜柱的柱效、容量和滲透特性,延長(zhǎng)柱子的使用壽命非常重要。色譜柱使用時(shí)間后***會(huì)出現(xiàn)柱壓升高、柱效降低、峰形畸變和分離度降低、保留時(shí)間 改變等變化,如不采取措施,將會(huì)縮短色譜柱的使用壽命,影響工作效率,并造成一定的經(jīng)濟(jì)損失。因此,有必要加強(qiáng)和規(guī)范色譜柱的管理,從而延長(zhǎng) 
    色譜柱的使用壽命。本文從影響色譜柱使用壽命的幾個(gè)因素出發(fā),從管理的角度,探討色譜柱的維護(hù)與保養(yǎng)。  
1 色譜柱常用的類型
    常 用的色譜柱填充劑有硅膠和化學(xué)鍵合硅膠、離子交換樹(shù)脂、凝膠或玻璃微球等填充劑。在化學(xué)鍵合硅膠中以十六烷基硅烷鍵合硅膠***常用,辛基硅烷鍵合硅膠次之, 氰基或氨基鍵合硅膠也有使用。近年來(lái),由于蛋白質(zhì)等生物大分子物質(zhì)分離提純技術(shù)的飛速發(fā)展,離子交換色譜柱、凝膠色譜柱的應(yīng)用也越來(lái)越廣。 


2 哪些因素影響色譜柱的使用壽命  
2.1 流動(dòng)相 


    在 以水溶液為流動(dòng)相時(shí),水溶液中的微生物例如細(xì)菌容易生長(zhǎng),當(dāng)用水溶液或有機(jī)酸緩沖液保護(hù)柱子時(shí),一些霉菌可能在色譜柱中滋生,堵塞固定相顆粒間的空隙。由 于濕法填充技術(shù)的問(wèn)世,目前普遍使用的色譜柱填料直徑一般都小于10um,流動(dòng)相中的顆粒雜質(zhì)很容易先沉積在柱頭然后慢慢堵塞柱子。流動(dòng)相的pH值對(duì)色譜 柱也有影響,特別是對(duì)化學(xué)鍵合硅膠填料,水溶液的pH***適范圍在2~7.5之間,當(dāng)pH>8時(shí),硅膠會(huì)釋出生成絮狀物堵塞柱子,且難以復(fù)原,柱效很 快降低,甚至******失效。當(dāng)在緩沖液中加入有機(jī)溶劑例如甲醇或乙腈時(shí),鹽類的溶解度下降,會(huì)析出鹽沉淀,堵塞柱子。同時(shí)流動(dòng)相中的有機(jī)溶劑和鹽會(huì)腐蝕色譜柱 頭的篩板,產(chǎn)生柱頭凹陷。流動(dòng)相的極性對(duì)柱子也有一定影響,對(duì)于硅膠柱,甲醇、水、冰乙酸等極性較大物質(zhì)會(huì)破壞填料,反之,對(duì)于化學(xué)鍵合硅膠,極性小的物 質(zhì)如正丁醇、二氯甲烷等也起同樣的作用。堿性溶液會(huì)破壞陽(yáng)離子交換樹(shù)脂色譜柱,而酸性溶液容易損壞陰離子交換樹(shù)脂柱。 
2.2 固定相于樣品


    如 果有少量或微量的樣品不能夠溶解在流動(dòng)相中,在通過(guò)固定相會(huì)堵塞柱子。樣品中的顆粒雜質(zhì)也會(huì)堵塞柱子。樣品組分例如糖、蛋白質(zhì)等通過(guò)柱子時(shí)會(huì)產(chǎn)生不可逆吸 附,這樣固定相的活性點(diǎn)被覆蓋。樣品組分還會(huì)與固定相產(chǎn)生反應(yīng),尤其是對(duì)于氨基柱的影響較為嚴(yán)重,因?yàn)榘被着c酐、酮形成希夫(Schiff)縮合而減少 活性點(diǎn),使保留時(shí)間縮短。色譜柱鍵合相基團(tuán)脫落、固定相分解和活性基團(tuán)變性以及會(huì)影響柱效和保留時(shí)間的顯著改變。大多數(shù)鍵合相都是通過(guò)硅氧硅鍵(Si- O-Si)連接在硅基質(zhì)上,形成帶有有機(jī)基團(tuán)的固定相Si-O-Si-R(R為CnH2n+1),硅氧硅鍵可能在水溶液中水解而斷裂,使鍵合基團(tuán)脫落。 


3 高效液相色譜柱的管理
3.1 色譜柱的管理 


    制 定色譜柱管理的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程并嚴(yán)格執(zhí)行。每一根新購(gòu)進(jìn)的色譜柱必須造冊(cè)登記,內(nèi)容包括:生產(chǎn)公司、品名、型號(hào)、規(guī)格、購(gòu)進(jìn)時(shí)間、啟用時(shí)間、單價(jià)、柱內(nèi)保護(hù) 溶液等。色譜柱分類存放,硅膠柱、化學(xué)鍵合硅膠柱、氰基或氨基柱、離子交換樹(shù)脂柱、凝膠柱各用一個(gè)色譜柱盒,盒上貼上標(biāo)簽,注明類別。隨柱說(shuō)明書(shū)裝入密實(shí) 袋附在登記本上。每啟用一根色譜柱,在色譜柱上貼上標(biāo)簽,注明啟用日期。每根柱子每?jī)蓚€(gè)月保養(yǎng)一次,特別是對(duì)于一些使用頻率少的柱子,因?yàn)榉胖脮r(shí)間長(zhǎng),容 易干柱,每一次做好保養(yǎng)記錄。對(duì)于確已失效的柱子,做好停用記錄,不能隨意丟棄,專門存放,如果現(xiàn)用的柱子的填料需要,可以用存放的柱子的填料。在從 事生產(chǎn)的單位的質(zhì)檢部門,對(duì)于使用時(shí)間較長(zhǎng)柱效降低的柱子,可把它用于檢測(cè)產(chǎn)品的中間體。
3.2 色譜柱的保養(yǎng) 


    色譜柱使用一段時(shí)間后,常遇到柱子被污染,柱效會(huì)有一定程度的下降,采用適當(dāng)?shù)姆椒▽?duì)色譜柱進(jìn)行保護(hù),可以延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命。 


    樣 品和流動(dòng)相的處理:溶解的樣品進(jìn)樣前用濾膜過(guò)濾,以除去不溶物。如果必要,需進(jìn)行樣品的預(yù)處理。流動(dòng)相中如有不純物質(zhì)將影響柱效,所以溶劑盡量使用色譜級(jí) 別的,至少是分析純級(jí)別,流動(dòng)相使用前用微孔薄膜過(guò)濾。在流動(dòng)相的輸液管前安裝過(guò)濾器。過(guò)濾器定期用甲醇超聲清洗,如果效果不好,可用10%的稀硝酸浸泡 清洗。對(duì)于堵塞嚴(yán)重的過(guò)濾器,可在火焰上灼燒后再清洗。 
    保護(hù)柱(預(yù)柱)的使用:對(duì)于較昂貴的色譜柱,可以在柱前加一保護(hù)柱,防止樣品中雜質(zhì)污染分析柱,對(duì)于制備柱,因其進(jìn)樣量大,使用保護(hù)柱尤為重要。


    常規(guī)處理:硅膠、氧化鋁、極性鍵合相色譜柱每一次用完后用低流速長(zhǎng)時(shí)間的二氯甲烷或正己烷等溶劑沖洗;鍵合相硅膠色譜柱、離子交換色譜柱和凝膠色譜柱先用蒸餾水沖洗,再用甲醇沖洗,然后用甲醇與蒸餾水以一定比例混合的溶液沖洗后過(guò)夜。 


    對(duì) 于已使用一段時(shí)間后柱效下降的色譜柱可按以下方法進(jìn)行再生。再生處理包括活化(右→左)和凈化(左→右)兩種。硅膠、氧化鋁、極性鍵合相色譜柱按下列順序 沖洗:******基戊烷或己烷←→三氯乙烷←→乙酸乙脂←→丙酮←→乙醇←→水。鍵合相硅膠柱:蒸餾水←→甲醇(沖洗過(guò)程中可加入少量二甲基甲酰胺)。離子交換 樹(shù)脂柱:高濃度的NaCl溶液(1-2molL的NaCl溶液)可使大部分樹(shù)脂再生,油脂等少數(shù)與樹(shù)脂緊密結(jié)合的物質(zhì)可用低濃度堿溶液(如0.1molL 的NaOH溶液)沖洗,酸性有機(jī)物吸附在固定相的用低pH緩沖液沖洗,堿性有機(jī)物用高pH緩沖液沖洗,然后再用蒸餾水←→甲醇←→二氯甲烷←→甲醇←→蒸 餾水沖洗。凝膠色譜柱:由于凝膠色譜柱是根據(jù)被分離物質(zhì)的分子量大小而分離物質(zhì),通常用稀的氫氧化鈉或非離子型去垢劑(0.2%-1%NP-40或 Lubrol)沖洗可除去大部分的結(jié)合物質(zhì),如果一些污染物仍然不能清除時(shí),用24%或30%乙腈沖洗過(guò)夜可除去疏水蛋白,用30%-50%乙酸可除去親 水蛋白,用蛋白水解酶處理可分解凝膠中剩余的痕量,然后再用蒸餾水←→甲醇←→蒸餾水沖洗。 


    已污染的色譜柱的處理:因 保留強(qiáng)的物質(zhì)污染,流動(dòng)相或樣品中不溶物沉積于柱頭,可用下列方法洗滌:去除脂類可用四氫呋喃、乙腈或甲醇洗滌;去除蛋白質(zhì)可用乙腈、丙醇和1%三 進(jìn)行梯度洗脫;一些高疏水性化合物可用乙腈或甲醇洗脫,同時(shí)反復(fù)注入100-200ml的四氫呋喃。 


   柱頭處理:對(duì)于柱頭堵塞污染 嚴(yán)重的情況而且用溶劑沖洗無(wú)效的色譜柱,只有打開(kāi)柱子去除柱頂?shù)奶盍现匮b:先拆下不銹鋼燒結(jié)過(guò)濾器,檢查柱床,常見(jiàn)凹陷或受污染的帶色填料,剔去不規(guī)則床 層和帶色填料,使柱床顯白色并******水平,再用甲醇作糊狀填料勻漿液,將糊狀填料勻漿液滴在柱上靠重力從勻漿液中排出甲醇液,重復(fù)直到填料水平。

柱 子的貯存:首先柱子必須清洗干凈后才能貯存,柱子不能貯存在水或水性溶劑中,否則會(huì)引起微生物的滋生。極性色譜柱可用適當(dāng)溶劑如二氯甲烷沖洗;鍵合相色譜 柱用甲醇沖洗;陰離子交換色譜柱用0.002%洗必泰(雙氯苯雙胍己烷)的緩沖液沖洗,陽(yáng)離子交換色譜柱用0.005%硫柳汞緩沖液沖洗;凝膠色譜柱用。

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