自去年我們介紹了《美天旎（miltenyi）**磁珠細(xì)胞分選過程中常見的問題》以來，受到大量細(xì)胞分選用戶的關(guān)注和好評(píng)，為此，我們將近期廣大用戶咨詢或了遇到的問題總結(jié)為美天旎（miltenyi）**磁珠細(xì)胞分選常見問題（二），以饗讀者。同時(shí)我們，歡迎大家通過佰樂良成網(wǎng)站（）和新浪微博（/bjbllc/）進(jìn)行提問。
1、 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行磁珠分選后，所要分選的目的細(xì)胞的陽性比率沒有變化或變化不大，為什么？
答：可能是抗體或protocol兩方面原因。
2、 很多文獻(xiàn)報(bào)道的磁珠分選和流式分選后細(xì)胞的活力是沒有差別的，不知數(shù)據(jù)是否合理？
答：一般來說，較好的磁珠分選和流式分選后細(xì)胞的活力是沒有差別的。
3、 磁珠分選所使用的磁珠相與流式分選所學(xué)抗體那個(gè)更經(jīng)濟(jì)？
答：單從價(jià)格角度看肯定是使用流式分選更經(jīng)濟(jì)，因?yàn)榱魇椒诌x所用的抗體也比磁珠便宜。但我們還需要考慮到價(jià)格以外的其他因素，比如分選速度、實(shí)驗(yàn)室條件是否能達(dá)到流式的無菌分選的要求等。
4、 美天旎的磁珠分選出來的細(xì)胞能直接做流式檢測(cè)嗎？
答：可以直接做流式檢測(cè)。
因?yàn)?/span>1、miltenyi的磁珠直徑只有50nm，比細(xì)胞小很多很多，不會(huì)影響細(xì)胞的光散射特性；另外，磁珠上沒有熒光標(biāo)記，所以也不會(huì)影響流式中熒光的激發(fā)。2、miltenyi的磁珠分選中，要通過分選柱將磁場(chǎng)擴(kuò)大1000倍，因此分選時(shí)只需很少的磁珠標(biāo)記上即可將細(xì)胞留在磁場(chǎng)中。其實(shí)磁性標(biāo)記只占用細(xì)胞表面抗原的20－30％的結(jié)合位點(diǎn)，不影響后面流式抗體再去結(jié)合細(xì)胞的。同時(shí)英愛根據(jù)細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)弱來選擇流抗：一般情況下，細(xì)胞表達(dá)較強(qiáng)，磁珠占據(jù)抗原表位的20-50%左右（如2000個(gè)分子中占500個(gè)）剩下的50%以上的位點(diǎn)還可以結(jié)合流抗，這種情況用同一個(gè)克隆號(hào)的檢測(cè)抗體就能檢測(cè)到我們的目標(biāo)marker的表達(dá)；但對(duì)于表達(dá)水平較弱（CD133，CD25，人CD117等）的marker，磁珠占據(jù)大部分位點(diǎn)，同一個(gè)克隆號(hào)的抗體無法再與同一個(gè)表位結(jié)合，只能選擇不同表位的流抗才能檢測(cè)到。針對(duì)biotin偶聯(lián)抗體的間標(biāo)分選，我們也可以選擇偶聯(lián)熒光素的抗抗體檢測(cè)，如CD25-biotin也可以用biotin-PE/APC檢測(cè)。對(duì)于這種弱表達(dá)的情況，建議大家選擇抗體*好是PE等強(qiáng)熒光素偶聯(lián)的。
5、 美天旎的磁珠與Dynal的分選器可以配套使用嗎？
答：不可以相互替換使用。因?yàn)?/span>Dynal的分選磁珠體積較大，*小的也在直徑1um，這種大體積的磁珠可以與磁場(chǎng)直接作用，但對(duì)細(xì)胞損傷大，而且容易在分選過程中刺激細(xì)胞而使其活化；而美天旎的磁珠只有50nm，這種體積小的磁珠需要通過分選柱放大磁場(chǎng)1000到10000倍進(jìn)行分選（miltenyi磁性分選器是特制的，可以滿足磁場(chǎng)放大的需求），這樣即可以具有很好的細(xì)胞分選效果，又可以減少對(duì)細(xì)胞的損害，更重要的是美天旎這種小體積的磁珠不會(huì)活化細(xì)胞，對(duì)下游實(shí)驗(yàn)不會(huì)產(chǎn)生影響。
6、 MACS相比FACS的優(yōu)點(diǎn)：
1. 適合大批量的細(xì)胞分選，FACS分選速度相對(duì)而言要慢很多；
2.穩(wěn)定性高，重復(fù)性強(qiáng)，而FACS由于機(jī)器運(yùn)行時(shí)間長會(huì)導(dǎo)致參數(shù)漂移故而實(shí)際獲取得靶細(xì)胞陽性率會(huì)大大下降；
3.無須大型設(shè)備，普遍適合大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室的細(xì)胞分選工作；
4.操作簡單，無須專門的設(shè)備操作人員（FACS操作需要一定的經(jīng)驗(yàn)）。
7、 磁珠分選細(xì)胞注意事項(xiàng)：
1.待分選細(xì)胞中如有貼壁細(xì)胞，建議在分選前先貼壁培養(yǎng)去除，或者提高EDTA濃度；
2.抗體包被磁珠對(duì)死細(xì)胞常有非特異性結(jié)合。因而分選前去除死細(xì)胞；
3.新鮮分離骨髓細(xì)胞，先用膠原酶、DNA酶、聯(lián)合消化，可使細(xì)胞團(tuán)塊解聚，從而提高分離效率。
4.上分離柱前，充分振蕩，混懸細(xì)胞，打散細(xì)胞團(tuán)塊；
5.用分離柱分選，應(yīng)用真空抽濾水，減少水中氣泡，使分離柱不被氣泡阻滯；
6.細(xì)胞懸液加入分離柱中時(shí)，應(yīng)將滴管伸至底壁后加入，避免將細(xì)懸液沿管壁流入，使管壁殘流末分選細(xì)胞，以致后繼洗柱過程中，因疏忽末被洗下，*后導(dǎo)致純度不高。洗柱時(shí)，應(yīng)在前次液體充分流盡后，再加洗液。
7.分選細(xì)胞量應(yīng)根據(jù)說明書控制，不超量；
8.孵育時(shí)間和溫度應(yīng)按說明書進(jìn)行，延長孵育時(shí)間、提高溫度會(huì)增加非特異結(jié)合；
9.先用抗體阻斷Fc受體，可降低非特異性結(jié)合；
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