光片顯微鏡（LSFM）使用薄層光激發(fā)焦面上的熒光分子。它具有真正意義上的光學(xué)切片能力，所以可以提供（相對(duì)于傳統(tǒng)顯微鏡）更高的軸向分辨率、極低的光漂白和光毒性，并且可達(dá)到幾十甚至上千幀的幀速。光片顯微鏡被廣泛應(yīng)用于透明化大樣品的深度分析，以及對(duì)活體生物樣品進(jìn)行高時(shí)空分辨率的3D長(zhǎng)時(shí)間觀察。獨(dú)立的照明和檢測(cè)通道是光片技術(shù)的配置。片層照明（SPIM）和數(shù)字掃描光片（DSLM）是各種光片設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)。在這篇綜述文章里，作者會(huì)談到光片顯微鏡的光學(xué)設(shè)計(jì)、技術(shù)細(xì)節(jié)、數(shù)據(jù)處理考量、應(yīng)用、局限性以及未來的趨勢(shì)；會(huì)比較不同的樣品放置方法，包括自制樣品倉(cāng)、玻片、多孔板等；會(huì)討論光片技術(shù)的各種應(yīng)用，包括脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物的胚胎、大腦和心臟研究、3D細(xì)胞培養(yǎng)模式、單細(xì)胞、組織切片、植物和機(jī)體相互作用以及全腦成像等。此外, 還有光片技術(shù)和其他成像技術(shù)的結(jié)合, 從而實(shí)現(xiàn)超分辨、提高穿透深度，以及通過光操作達(dá)到更多維度的觀測(cè)等。

理論上光片不會(huì)照亮焦面以外的熒光分子，如果需要對(duì)復(fù)雜3D結(jié)構(gòu)成像或者在3維層面進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察時(shí)，光片顯微鏡的優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)得明顯。

光路設(shè)計(jì)

光片技術(shù)包括至少一支激光、一個(gè)照明激發(fā)光路、電動(dòng)載物臺(tái)、一個(gè)垂直于激發(fā)光路的成像檢測(cè)光路、一臺(tái)高配置的工作站來保存和處理數(shù)據(jù)。激發(fā)光路用于把準(zhǔn)直的激光轉(zhuǎn)化為光片。常用的有兩種方法：SPIM采用柱面鏡產(chǎn)生靜態(tài)光片；DSLM采用電動(dòng)控制的振鏡高速掃描激光束產(chǎn)生動(dòng)態(tài)光片，因?yàn)檫@種方法可以對(duì)光束形狀進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)調(diào)整，所以絕大多數(shù)需要提高光片空間分辨率的設(shè)計(jì)都采用這種照明方式。檢測(cè)光路與激發(fā)光路垂直，其光路設(shè)計(jì)跟大多數(shù)寬場(chǎng)顯微鏡的檢測(cè)光路類似。

光片性質(zhì)

一個(gè)的光片在xy層面上應(yīng)該盡量長(zhǎng)，在z層面上應(yīng)該盡量薄且均勻。但是受限于物理光學(xué)儀器的限制，實(shí)際實(shí)驗(yàn)中永遠(yuǎn)不能實(shí)現(xiàn)。實(shí)際應(yīng)用中的光片大多是高斯光束（Gaussian Beam），雖然其他的光束比如貝塞爾光束（Bessel Beam）和艾里光束（Airy Beam）也有應(yīng)用。

光片設(shè)計(jì)有幾個(gè)最基本也最重要的參數(shù)。一是光腰，也就是光片中心區(qū)域的厚度，光腰厚度跟激光波長(zhǎng)以及激發(fā)物鏡的NA值相關(guān)。二是光束的有效長(zhǎng)度（視野大小），則跟光腰厚度直接關(guān)聯(lián)。三是檢測(cè)物鏡的工作距離，它直接決定了的樣品掃描厚度，并和光束長(zhǎng)度一起定義了可成像體積。四是橫向分辨率，影響橫向分辨率的是激發(fā)波長(zhǎng)以及檢測(cè)物鏡的NA值。五是軸向分辨率，需要根據(jù)激發(fā)和檢測(cè)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)計(jì)算，與兩個(gè)物鏡NA值、激發(fā)以及熒光發(fā)射波長(zhǎng)、溶液折射率都有關(guān)系。詳細(xì)計(jì)算公式可參照原文。

照明與檢測(cè)物鏡

照明與檢測(cè)物鏡的設(shè)計(jì)一般可分為兩類：一是基于不同形狀樣品倉(cāng)的設(shè)計(jì)，主要應(yīng)用是高內(nèi)涵成像（high content imaging）；一是基于平面樣品平臺(tái)設(shè)計(jì)，主要應(yīng)用于高通量成像（high-throughput imaging），樣品載體一般是玻片、多孔板等。

基于樣品倉(cāng)的設(shè)計(jì)大部分使用低到中NA值的空氣物鏡或者水浸式物鏡照明，中高NA值的水浸式物鏡用于檢測(cè)。這種設(shè)計(jì)一般用于（較）大樣品，比如整個(gè)胚胎、3D細(xì)胞團(tuán)、3D類器官等進(jìn)行高內(nèi)涵成像。大多數(shù)設(shè)計(jì)也會(huì)包含旋轉(zhuǎn)載物臺(tái)，從不同角度對(duì)樣品成像，以實(shí)現(xiàn)xyz三軸同向分辨率，一些設(shè)計(jì)采用多個(gè)照明光路用于提高樣品照明的均勻度，還有一些設(shè)計(jì)使用多個(gè)成像光路來增加成像速度和成像深度。

平面樣品平臺(tái)設(shè)計(jì)包括倒置以及正置光片，樣品放在常規(guī)或者自定義的玻片、多孔板上，多用于高通量掃描，比如大規(guī)模的藥物篩選。但是這種設(shè)計(jì)對(duì)于物鏡的限制較多，并且樣品不能旋轉(zhuǎn)。這種設(shè)計(jì)也可引入微流控系統(tǒng)，控制樣品沿毛細(xì)微管移動(dòng)成像。

傾斜光片(Oblique plane microscope)采用單物鏡激發(fā)和檢測(cè)熒光信號(hào)。這種設(shè)計(jì)中光片以一個(gè)傾斜角度進(jìn)入樣品。傾斜光片的優(yōu)勢(shì)在于可以使用單只高NA物鏡（可達(dá)1.35）進(jìn)行激發(fā)和成像，并且適配絕大多數(shù)常規(guī)放樣方法。另外一個(gè)巨大的優(yōu)勢(shì)是光片和物鏡焦面校準(zhǔn)的穩(wěn)定性。常規(guī)光片會(huì)因?yàn)闇囟鹊淖兓绊憣?duì)焦的穩(wěn)定，但是在傾斜光片中，溫度會(huì)同時(shí)對(duì)光片位置和物鏡焦面施加相同程度的影響，所以成像相對(duì)位置不會(huì)變化。也有其他的單物鏡光片顯微鏡引入原子力顯微鏡懸臂、多模光纖、或者定制光學(xué)部件進(jìn)行成像。

熒光染料

所有常規(guī)用于熒光成像的染料或者蛋白都可以被用于光片成像，并且對(duì)于一些對(duì)光漂白特別敏感的染料，光片會(huì)有較大的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)楣馄@微鏡的光毒極低。對(duì)于活體成像一般需要內(nèi)源表達(dá)的蛋白，長(zhǎng)波段激發(fā)比短波段的更適合生物樣品，在透明化樣品中的散射也會(huì)更少。

化學(xué)遺傳標(biāo)記指示劑比如SNAP-tags、Halo-Tags，因?yàn)楸仨毰c感興趣蛋白結(jié)合才能發(fā)光，所以一般能消除背景熒光噪音。

樣品固定

光片顯微鏡的樣品固定方法多種多樣，只要能保持樣品3D形態(tài)或者活體樣品活性即可。大多數(shù)高內(nèi)涵成像的樣品固定方法都與傳統(tǒng)熒光顯微鏡固定樣品的方法不同。 固定方法必須保證樣品在整個(gè)空間的可操作性、定位的精準(zhǔn)性、以及空間轉(zhuǎn)換的可靠性。另外，樣品固定必須盡量減少照明以及檢測(cè)光移動(dòng)的距離，所以對(duì)于非球形樣品，最長(zhǎng)軸是沿Y軸（非照明和檢測(cè)）方向，這也對(duì)提高橫向分辨率有極大的幫助，并盡可能的增加可成像空間體積。對(duì)于各種各樣的樣品，比如小鼠運(yùn)動(dòng)軸突、鼠腦、小鼠器官、斑馬魚、胚胎、植物、人類及小鼠免疫細(xì)胞、類器官等，都可以找到開源的樣品固定裝置和成像步驟說明。

用于發(fā)育生物學(xué)的斑馬魚和其他大部分昆蟲模式動(dòng)物都是卵生生物，胚胎不需要外部營(yíng)養(yǎng)供給，所以活體成像時(shí)樣品大部分固定在低濃度瓊脂糖內(nèi)部或者表面。固定樣品的管子可以是玻璃毛細(xì)管或者管壁極薄的FEP管。一般多個(gè)樣品可以被同時(shí)固定，用來增加通量或者對(duì)比實(shí)驗(yàn)。

胎生生物比如老鼠和其他哺乳動(dòng)物的胚胎更加脆弱，所以樣品固定的步驟也更加復(fù)雜。植入前的胚胎已經(jīng)被證明可以在FEP薄膜上穩(wěn)定的成像。植入后的胚胎對(duì)樣品固定的挑戰(zhàn)更大，但是也有已發(fā)表的詳細(xì)步驟可以參考。原理上，固定樣品的上樣和上面提到的卵生生物上樣差別不大，而活體樣品的上樣需要無菌環(huán)境、以及精確的環(huán)境控制，包括溫度、濕度、二氧化碳和成像介質(zhì)等。這些在光片顯微鏡的設(shè)計(jì)中都要考慮。并且在實(shí)際成像中還有很多其他因素，比如適合樣品生長(zhǎng)的凝膠一般會(huì)吸收和散射光。商品化介質(zhì)中包含的酚紅會(huì)降低信噪比等等。

植物樣品的上樣比較特殊，但是遠(yuǎn)比不上胚胎上樣的復(fù)雜性。主要需要考慮的因素包括成像視野是否能涵蓋植物生長(zhǎng)的空間、重力、生長(zhǎng)方向以及光照的影響。

3D成像

光片顯微鏡成像前一定要經(jīng)過校準(zhǔn)。3D成像過程中，一般通過移動(dòng)樣品，在z軸各個(gè)層面拍攝2D圖片并合成為3D圖片。較大的不透明樣品也需要通過移動(dòng)xy軸進(jìn)行拼接，或者旋轉(zhuǎn)進(jìn)行多角度成像。光片本身也可以移動(dòng)來實(shí)現(xiàn)均勻的照明。

光片成像中一個(gè)常見的現(xiàn)象是會(huì)有較亮或者較暗的條狀圖案，這是由生物樣品上某些特定結(jié)構(gòu)對(duì)光的散射或者吸收造成的。可以通過快速旋轉(zhuǎn)照明光（Pivoting），也可通過聲光偏轉(zhuǎn)器(acousto-optical deflectors)、全息擴(kuò)散片(elliptical holographic diffusers)、或者自再現(xiàn)光束（Self-reconstructing beam) 減少對(duì)成像的影響。

雖然光片理論上只照亮焦面上的熒光分子，但是樣品本身對(duì)激發(fā)光的散射會(huì)造成焦面以外的信號(hào)被激發(fā)，從而降低圖片信噪比。通過結(jié)構(gòu)光照明以及后期重建可以抑制焦面外的噪音并提高圖片質(zhì)量。但是結(jié)構(gòu)光需要對(duì)同一樣品至少進(jìn)行3次成像，所以會(huì)降低時(shí)間分辨率。另外可以利用相機(jī)卷簾快門的特性，讓入射光掃描和相機(jī)卷簾快門同步，從而隔絕焦面外的噪音。并且成像速度基本不會(huì)受到影響。

光片也可以與其他成像技術(shù)結(jié)合滿足其他的應(yīng)用需求，比如拉曼光譜儀、FCS、FLIM、FRAP等。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

取決于具體的應(yīng)用，光片結(jié)果可能包括多個(gè)樣品、幾百甚至上千個(gè)時(shí)間點(diǎn)、幾十個(gè)視野拼接（取決于樣品大?。⒍鄠€(gè)成像角度、達(dá)6個(gè)熒光通道。每個(gè)實(shí)驗(yàn)可能有幾個(gè)TB的原始數(shù)據(jù)，比傳統(tǒng)熒光顯微鏡高幾個(gè)量級(jí)。所以在建立光片實(shí)驗(yàn)之前，整個(gè)平臺(tái)的數(shù)據(jù)保存、備份、處理、擴(kuò)展[d1] 和維護(hù)都必須事先考慮到。

數(shù)據(jù)處理和可視化

在實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)保存結(jié)束之后，原始數(shù)據(jù)必須經(jīng)過數(shù)據(jù)處理來糾正技術(shù)誤差，壓縮文件大小，重建復(fù)雜的空間定位以及進(jìn)行可視化，保存?zhèn)浞莺头治鼋Y(jié)果。FIJI是個(gè)非常完善的開放平臺(tái)，并且有各個(gè)實(shí)驗(yàn)組持續(xù)不斷地開發(fā)插件來進(jìn)行通用的或者定制的實(shí)驗(yàn)分析方案。

常規(guī)的預(yù)處理包括矯正熱像素(hot pixels)/死像素(dead pixels)，扣除背景，無損/有損壓縮，系統(tǒng)化的文件命名等。

大樣品或者透明樣品需要高效、精確、并且可擴(kuò)展的圖像拼接重建完整的3D樣品。多側(cè)/多角度成像的樣品需要采用基于圖像的變換矩陣或者基于興趣點(diǎn)的圖片配準(zhǔn)和對(duì)齊進(jìn)行融合。反卷積是有效的提高信噪比的手段。這些處理方法可以結(jié)和起來使用，并且現(xiàn)在也有成熟的開源配套插件。其他進(jìn)一步的矯正和調(diào)整方法包括樣品位置偏移矯正、球面相差和色差矯正、光漂白矯正等。

渲染工具是個(gè)可以對(duì)處理之后圖片進(jìn)行可視化的有效手段。這些渲染工具允許用戶對(duì)樣品圖像進(jìn)行任意角度的觀察，任意位置的切割，并且對(duì)于復(fù)雜的樣品形態(tài)能通過表面渲染、陰影高亮或者透明化處理等手段讓觀察更直觀明顯。

使用常規(guī)電腦進(jìn)行光片數(shù)據(jù)的處理一般都不可行，因?yàn)閳D片大小很有可能超過內(nèi)存的大小。一些開源插件比如 BigDataViewer采用ImgLib2通過虛擬數(shù)據(jù)和緩存可以避免這種問題。BigStitcher插件可以進(jìn)行上面提到的絕大部分處理步驟。其他可以處理光片數(shù)據(jù)的插件或者開源軟件包括 Vaa3D、TeraStitcher等。

ClearVolume插件可以在實(shí)驗(yàn)期間實(shí)時(shí)檢查圖片。其他可視化或者渲染插件包括3Dscript（創(chuàng)建動(dòng)畫）、TeraFly（Vaa3D和Scenery的插件）可以使用VR頭顯進(jìn)行互動(dòng)式的觀察。BigVolumeViewer可以進(jìn)行不限大小的數(shù)據(jù)渲染。UCSF Chimera也可以用來進(jìn)行光片數(shù)據(jù)的可視化。除了開源軟件/插件, 也有不少商品化軟件提供了友好的操作界面和對(duì)現(xiàn)有商業(yè)光片顯微鏡文件的兼容。