分子熒光光譜法與化學(xué)發(fā)光分析法

物質(zhì)的基態(tài)分子吸收能量（電能、熱能、化學(xué)能和光能等）被激發(fā)到較高電子能態(tài)，從不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)躍迂回基態(tài)并發(fā)射出光子，此種現(xiàn)象稱為發(fā)光?；诜肿影l(fā)光建立起來(lái)的方法稱為分子發(fā)光光譜法(molecular luminescence spectrometry)。分子發(fā)光光譜法包括分子熒光光譜法（molecular fluorescence spectrometry）、分子磷光光譜法(molecularosphorescence spectrometry）、化學(xué)發(fā)光分析法（chemiluminometry）和生物發(fā)光法(bioluminescence)。
熒光和磷光同屬光致發(fā)光，發(fā)射熒光時(shí)電子能量轉(zhuǎn)移不涉及電子自旋改變，熒光壽命較短（10^-11～10^-7 S）。熒光是由單重態(tài)—基態(tài)躍遷產(chǎn)生的，受激發(fā)的自旋狀態(tài)不發(fā)生變化。磷光是由三重態(tài)—基態(tài)躍遷產(chǎn)生的，發(fā)射磷光時(shí)伴隨電子自旋的改變，在輻射停止幾秒或更長(zhǎng)一段時(shí)間后，仍能檢測(cè)到磷光，磷光壽命略長(zhǎng)(10^-4～10 s)。
化學(xué)發(fā)光是指某些物質(zhì)在進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)時(shí)，由于吸收了反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生的化學(xué)能，反應(yīng)產(chǎn)物分子由基態(tài)激發(fā)至激發(fā)態(tài)，受激分子由激發(fā)態(tài)再回到基態(tài)時(shí)，發(fā)出一定波長(zhǎng)光的過程。生物發(fā)光是指生物體發(fā)光或生物體提取物在實(shí)驗(yàn)室中發(fā)光的現(xiàn)象，是由細(xì)胞合成的化學(xué)物質(zhì)，在一種特殊酶的作用下，將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為光能。
分子熒光光譜法的基本原理:
分子受光能激發(fā)后，由電子激發(fā)單重態(tài)(S1)躍迂回到基態(tài)的任一振動(dòng)能級(jí)時(shí)所發(fā)出的光輻射稱為分子熒光。由于分子對(duì)光的吸收具有選擇性，因此熒光的激發(fā)和發(fā)射光譜是熒光物質(zhì)的基本特征。測(cè)定激發(fā)光譜時(shí)，通常是在一定的狹縫寬度下，固定待測(cè)物質(zhì)的發(fā)射波長(zhǎng)，然后改變激發(fā)光的波長(zhǎng)，測(cè)量不同激發(fā)光波長(zhǎng)所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度的變化。熒光強(qiáng)度處所對(duì)應(yīng)的激發(fā)波長(zhǎng)就是宜的激發(fā)波長(zhǎng)，稱為激發(fā)波長(zhǎng)。此時(shí)分子吸收的能量，能產(chǎn)生的熒光。測(cè)定發(fā)射光譜時(shí)，是將激發(fā)光波長(zhǎng)固定在激發(fā)波長(zhǎng)處，然后不斷改變熒光的發(fā)射波長(zhǎng)，測(cè)定不同的發(fā)射波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度的變化。通常用λex和λem分別表示激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)。激發(fā)光譜和發(fā)射光譜可用于鑒別熒光物質(zhì)，并可作為熒光測(cè)定時(shí)選擇激發(fā)波長(zhǎng)和測(cè)定波長(zhǎng)的依據(jù)。
在一定條件下儀器所測(cè)得熒光物質(zhì)發(fā)射熒光的大小用熒光強(qiáng)度來(lái)衡量。熒光是向四周發(fā)射的，沒有固定方向，是各向同性的，因此實(shí)際上測(cè)量的是某一方向的熒光強(qiáng)度。熒光是光致發(fā)光，而物質(zhì)吸收光以后再發(fā)射光，所以熒光強(qiáng)度應(yīng)與入射的光強(qiáng)度以及熒光量子產(chǎn)率成正比。熒光強(qiáng)度與濃度成正比。需要指出的是，這樣的正比關(guān)系式只有在被測(cè)物的濃度較低時(shí)才成立。

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