弱極性色譜柱在反相色譜中用的填料常是以硅膠為基質(zhì)，表面鍵合有極性相對(duì)較弱的官能團(tuán)的鍵合相。反相色譜所使用的流動(dòng)相極性較強(qiáng)，通常為水、緩沖液與甲醇、乙腈等的混合物。
樣品流出色譜柱的順序是極性較強(qiáng)的組份先被沖洗出，而極性弱的組份會(huì)在色譜柱上有更強(qiáng)的保留。常用的反相填料有C18、C8、C4、C6H5等。
隨著色譜柱的保護(hù)柱長度加長，樣品的保留時(shí)間會(huì)比使用短保護(hù)柱長。一般來說，保護(hù)柱的內(nèi)徑與分析色譜柱的內(nèi)徑相同或相當(dāng)即可。保留時(shí)間的變化指兩種類型的情況，一種是同一根柱樣品間的保留變化，第二種類型主要是填料的差異造成的，許多實(shí)驗(yàn)都會(huì)碰到。
不同牌號(hào)的色譜柱分離的色譜峰保留時(shí)間可在小范圍內(nèi)移動(dòng)，但峰的順序和分辨率不變，可改變流速或溶劑強(qiáng)度(反相色譜加水調(diào)節(jié))進(jìn)行校正。如果譜圖中色譜順序發(fā)生了變化，或者兩峰重疊在一起，問題就比較嚴(yán)重。保留時(shí)間發(fā)生大的變化，主要由柱填料硅酸相互作用所致，另外有次級(jí)保留因素的影響。硅膠為基質(zhì)的填料表面含有硅醇，有的封尾填料可部分去掉硅醇、不封尾填料的硅膠表面硅醇基更多。酸性或堿性分子可與硅醇發(fā)生不同程度的相互作用。硅酸與樣品分子作用的強(qiáng)弱，因不同批號(hào)的硅膠和不鍵合相填料而異。即使同批號(hào)的硅膠而不同批號(hào)的鍵合相也有差異。硅醇對(duì)陽離子或堿性樣品影響大。
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